J2-7196 Antibakterijske nanostrukturirane zaščitne plasti za biološke aplikacije

Vodja projekta: dr. Aleksandra Kocijan 

Projekt je bil financiran s strani ARRS z 2774 letnimi urami cenovnega razreda C: 1. 1. 2016 – 31. 12. 2018.

Člani projektne skupine:

Raziskovalni projekt je bil namenjen dizajniranju hibridnih anorganskih/organskih prevlek s pomočjo  različnih pristopov molekularnega inženiringa za zaščito površin iz nerjavnega jekla pred problemi povezanimi z biološkim nalaganjem organizmov v različnih naravnih okoljih. Osredotočali smo se na izboljšanje tehnologij za zaviranje korozije in  preprečevanje biološkega nalaganja z antibakterijskim učinkom z zmanjšanim negativnim vplivom na okolje, ki  zmanjšujejo stopnjo biološkega nalaganja preko fizikalno-kemijskih lastnosti površine. Razvijali smo hibridne anorgansko/organske premaze, ki temeljijo na podobnih inženirskih pristopih, vendar se razlikujejo v posebnih ciljanih lastnostih. Pripravljene nanostrukturirane površine smo fizikalno, kemijsko in mehansko ovrednotili za možne končne aplikacije v vodnem okolju in v biomedicini.

Glavni namen naše raziskave je bila priprava anorgansko/organskih kompozitov za zaščito nerjavnih jekel. V prvi vrsti smo se osredotočili na optimizacijo priprave prevlek za preprečevanje/zmanjšanje adhezije bioloških organizmov preko fizikalno-kemijskih lastnosti prevleke. Izbrali smo nanodelce TiO₂ in SiO₂ dveh velikosti, 30 nm in 100 nm, in biokompatibilno epoksidno smolo klasifikacije USP VI. Posebno pozornost smo namenili stopnji disperzije in mešanju nanodelcev v polimerno matriko za izboljšanje lastnosti kompozitne prevleke. Za regulacijo površinskih lastnosti smo s primerno kombinacijo dveh izbranih velikosti nanodelcev spreminjali nanohrapavost prevleke, z dodatno funkcionalizacijo s floriranjem nanodelcev pa omočitvene lastnosti. Po drugi strani pa nam je obdelava kovinske podlage z laserskim teksturiranjem odprla nove možnosti manipulacije površinskih lastnosti v kombinaciji z razvitimi prevlekami.

Pripravljene prevleke smo analizirali in določili njihovo mikrostrukturo, mehanske lastnosti in korozijsko odpornost v fiziološki raztopini. Prevleke smo preiskali z mikroskopskimi in spektroskopskimi metodami. Z mehanskimi preiskavami smo ovrednotili tribološke lastnosti prevlek. Omočljivost površine smo določili z meritvami kontaktnih kotov in površinske energije, korozijske lastnosti pa z elektrokemijskim preskušanjem v simulirani fiziološki raztopini. Ovrednotili smo tudi biokompatibilnost prevlek in njihove antibakterijske lastnosti.

V sklopu predlaganega projekta smo pridobili ustrezno temeljno znanje za izdelavo hibridnih anorganskih/organskih prevlek z visoko dodano vrednostjo za uporabo v bioloških medijih.

Glede na znanstvena izhodišča raziskovalnega projekta smo naše cilje strnili v naslednje točke:

Cilj 1: Optimizacija substrata in nanosa polimerne matrike 

V prvi fazi projekta smo optimizirali in poenostavili postopek priprave polimerne prevleke na površini nerjavnega jekla. Dobra adhezija prevleke in homogenost plasti je tu ključna za končno uporabo v praksi. Za izboljšanje adhezije kompozitne plasti z nanodelci se je izkazalo, predhodno nanešen tanek osnovni sloj epoksidne smole (približno 300 nm) zagotavlja optimalno pripravo končne zaščitne plasti, saj naravna oksidna plast, ki raste na površini substrata iz nerjavnega jekla preprečuje oprijem in jo je zelo težko odstraniti. Diske nerjavnega jekla smo zato predhodno zbrusili in diamantno spolirali do 1 μm, ultrazvočno očistili in posušili. Na površino smo nanesli dvokomponentno biokompatibilno epoksidno smolo EPO-TEK 302-3M, klasifikacije USP VI. Pri tem smo optimizirali viskoznost epoksidne smole z dodajanjem acetona za dosego popolne pokritosti površine. Primerno pripravljeno epoksidno smolo smo na kovinsko podlago nanašali s »spin-coaterjem«. Polimerizacijo plasti smo zagotovili s sušenjem pri 65 °C 1 h. 

Dodatno vejo raziskav je predstavljalo predhodno lasersko teksturiranje površine nerjavnega jekla, ki je odprlo nove možnosti prilagajanja površinskih lastnosti v kombinaciji s prevlekami. Za lasersko teksturiranje smo uporabili nanosekundni vlakenski laser. Teksturiranje je potekalo po vzporednih linijah v x oz. x-y smeri (mrežasta struktura) z razmikom 25, 50 in 100 μm. Na ta način smo si zagotovili dodatno možnost manipulacije hrapavosti površine.  

Cilj 2 : Priprava hibridnih anorgansko/organskih prevlek

V nadaljevanju smo se ukvarjali z nanosom nanodelcev TiO₂ in SiO₂ na osnovni sloj epoksidne smole. Uporabili smo delce dveh velikosti, 30 nm in 100 nm, ki smo jih predhodno ultrazvočno dispergirali v etanolu za razbitje aglomeratov in zagotavljanje boljše homogenosti suspenzije. Plast nanodelcev smo nanašali s »spin-coaterjem«. Po izbiri primernega masnega deleža nanodelcev, ki je nujen za optimizacijo površinskih in mehanskih lastnosti, smo raziskali vpliv velikosti delcev na hrapavost plasti. Izkazalo se je, da željeno hrapavost dosežemo s pripravo trikratnega nanosa dvoslojne kombinacije nanodelcev, v zaporedju velikosti 30 nm in nato 100 nm. Prevleko smo sušili 20 minut pri 100 ° C. 

Cilj 3 : Modifikacija površinskih lastnosti hibridnih prevlek 

V tem sklopu smo se ukvarjali s spreminjanjem omočitvenih lastnosti prevlek za različne aplikacije. V ta namen smo optimizirali pripravo prevlek z nefunkcionaliziranimi »as-received« in površinsko modificiranimi nanodelci. Nanodelce smo funkcionalizirali s hidrofobnim fluoroalkilsilanom (FAS).

Prevleke pripravljene z nemodificiranimi nanodelci so bile hidrofilne, saj so tako epoksidna smola, kot tudi nanodelci hidrofilni. Z optimizacijo hrapavosti in večkratnim nanosom dvosloja nanodelcev smo v nekaj korakih pripravili obstojno superhidrofilno zaščitno plast. 

Superhidrofobnost smo dosegli preko hrapavosti površine in z dodatno funkcionalizacijo nanodelcev z nizkoenergijskim floroalkilsilanom. Funkcionalizirani nanodelci v kombinaciji s floro-polimerno matriko, so en način za podaljšanje obstojnosti številnih hidrofobnih prevlek. Da bi čim bolje izrabili lastnosti superhidrofobne površine, smo raziskali povezavo med nanostrukturo in superhidrofobnostjo na površini in izdelali nanostrukturirano površino s prilagodljivo omočljivostjo, želenimi korozijskimi lastnostmi in odpornostjo na biološko nalaganje.

Ker so za določene aplikacije primerne plasti z zmerno hidrofilnostjo/hidrofobnostjo, smo takšno omočljivost dosegli s pripravo »sendvič« struktur, z nanosom dodatne plasti epoksidne smole na predhodno nanešeno plast nanodelcev. Z uporabo nemodificiranih nanodelcev smo dosegli zmerno hidrofilnost plasti s kontaktnim kotom 60-70°, z uporabo FAS-modificiranih nanodelcev pa zmerno hidrofobnost plasti s kontaktnim kotom okrog 120°.

Lasersko teksturirani vzorci so bili takoj po pripravi superhidrofilni, ne glede na razmik linij teksturiranja. Po nanosu FAS-modificiranih nanodelcev pa smo dosegli stabilno superhidrofobno plast.

Rezultati naših raziskav prikazujejo različne možnosti prilagajanja omočitvenih lastnosti s spreminjanjem fizikalno-kemijskih lastnosti kovinske površine.

Cilj 4 : Karakterizacija strukturnih, mehanskih in korozijskih lastnosti ter biološko ovrednotenje prevlek 

Morfologijo prevlek smo ovrednotili z vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM). Analiza kaže tipično  razliko v morfologiji med superhidrofilnimi in superhidrofobnimi plastmi, ki se odraža v različnih velikostnih redih aglomeratov nanodelcev. Izkazalo se je, da funkcionalizacija nanodelcev ne homogenizira njihove porazdelitve v epoksidni smoli, saj je plast z dodanimi FAS-TiO₂ nanodelci karakterizirana z aglomerati do nekaj deset mikronov. Po drugi strani pa je prevleka z nefunkcionaliziranimi TiO₂ nanodelci bolj homogena in opazimo aglomerate reda velikosti le nekaj mikronov. To smo potrdili z meritvami hrapavosti površine. 

Omočljivost površine smo določili z meritvami statičnih kontaktnih kotov in izračunali ustrezno površinsko energijo. Rezultati so potrdili uspešno pripravo dveh skrajnih primerov omočljivosti,  superhidrofobne FAS-TiO₂/epoksi prevleke in superhidrofilne TiO₂/epoksi prevleke.

Tribološke preiskave smo izvedli s tribometrom v enosmernem načinu v konfiguraciji točkovnega kontakta »ball-on-disc«. Za protiutež smo uporabili kroglo Al₂O₃ s premerom 6 mm (≈2000 HV). Meritve so potekale v treh različnih medijih, glede na vrsto aplikacije: laboratorijski pogoji,  deionizirana voda in simulirana fiziološka raztopina. V laboratorijskih pogojih ni bilo bistvene razlike v obrabi med superhidrofobnimi in superhidrofobnimi plastmi, v vodi in fiziološki raztopini pa je bil koeficient trenja bistveno nižji na superhidrofobnih plasteh v primerjavi s superhidrofobnimi. 

Korozijsko obnašanje smo raziskali v simulirani fiziološki Hankovi raztopini. Z elektrokemijsko impedančno spektroskopijo smo dokazali višjo korozijsko stabilnost preiskovanih vzorcev z nanosom zaščitnih plasti, zlasti z dodatkom TiO₂ nanodelcev. Poleg tega je bila za vse preiskovane prevleke jasno vidna visokofrekvenčna konstanta v primerjavi z osnovnim materialom, ki je značilna za barierne lastnosti. Ta učinek je bil izrazitejši za FAS-TiO₂/epoksi prevleko s faznim kotom, ki se približuje –90 °, kar je značilno za kondenzator in se pripisuje kapacitivnemu značaju plasti. Rezultati kažejo znatno izboljšanje korozijske stabilnosti epoksidnih prevlek z dodatkom nanodelcev TiO₂ v primerjavi s čisto epoksidno plastjo, zlasti v primeru superhidrofobne FAS-TiO₂/epoksi plasti, ki se kaže v višjih R vrednostih in nižjih CPE vrednostih. Dodatek nanodelcev zagotavlja boljše pregradne lastnosti zaradi podaljšanega prodiranja elektrolita skozi plast. S potenciodinamskimi meritvami smo dokazali, da se področje pasivacije za FAS-TiO₂/epoksi in FAS-SiO₂/epoksi prevleko izrazito premakne k nižjim gostotam korozijskega toka v primerjavi s čisto epoksidno plastjo na nerjavnem jeklu AISI 316L. Ugotovili smo, da je prisotnost nanodelcev v plasti bistveno povečala korozijsko odpornost nerjavnega jekla AISI 316L v primerjavi s čisto epoksidno smolo, še posebej v primeru FAS-TiO₂/epoksi prevleke.

V nadaljevanju smo dodatno nadgradili morfologijo osnovnega kovinskega materiala z laserskim teksturiranjem v kombinaciji s prevlekami in s tem bistveno vplivali na omočitvene in korozijske lastnosti površine. Pri izbranih parametrih laserskega teksturiranja se je izkazalo, da je površina z razmakom med črtami 50 µm optimalna. 

Biološko ovrednotenje je bilo namenjeno sistematičnemu, hierarhičnemu in iterativnemu ocenjevanju odpornosti nanostrukturiranih površin na nalaganje in adhezijo organizmov. Osnovni namen te ocene je bila potreba po zanesljivi kvantitativni oceni mikrobiološke populacije, ki nastopa v naloženi plasti. S fluorescenčno mikroskopijo smo ocenili delež živih in mrtvih celic adsorbiranih na testnih površinah s predhodnim barvanjem z ustreznimi barvili. S SEM smo nato natančno ovrednotili število, porazdelitev in obliko celic. Celotna populacija mikroorganizmov je bila ocenjena iz velikega števila naključnih izsekov analizirane površine. Biokompatibilnost smo preverjali z izpostavo pripravljenih površin osteosarkomskim celicam tipa MG-63. Biološko vrednotenje je pokazalo, da se glede na površinske lastnosti razvitih prevlek (hrapavost in omočljivost) celice močno razlikujejo po velikosti, obliki in površinski strukturi. Rezultati so pokazali, da je superhidrofilna TiO₂/epoksi plast na nerjavnem jeklu AISI 316L ugodnejša za kostne osteosarkomske celice v primerjavi s superhidrofobnimi FAS-TiO₂/epoksi plastmi. 

Antibakterijski učinek zaščitnih plasti smo preverjali z deležem pritrjenih E. coli celic (DSM 1576). Rezultati so pokazali, da je naseljenost z E. coli manjša za oba tipa prevlek TiO₂/epoksi in FAS-TiO₂/epoksi, v primerjavi z referenčno plastjo epoksidne smole brez dodanih delcev. S tem smo potrdili antibakterijski učinek TiO₂ nanodelcev v kombinaciji z omočljivostjo in hrapavostjo površine. Predstavljeni rezultati tako lahko spodbudijo nove strategije za pripravo površin nanodelcev titanovega dioksida za biomedicinske aplikacije.

Bibliografija:

1.01 Izvirni znanstveni članek

1. CONRADI, Marjetka, KOCIJAN, Aleksandra. Fine-tuning of surface properties of dual-size TiO[sub]2 nanoparticle coatings. Surface & coatings technology, ISSN 0257-8972. Oct. 2016, vol. 304, str. 486-491, [COBISS.SI-ID 1231018]

2. SEVER, Tina. Vpliv staranja na površinske lastnosti lasersko teksturiranih in kemijsko modificiranih površin : zaključna naloga. Ljubljana: [T. Sever], 2018. 35 str., [COBISS.SI-ID 3211876]

3. TRDAN, Uroš, HOČEVAR, Matej, GREGORČIČ, Peter. Transition from superhydrophilic to superhydrophobic state of laser textured stainless steel surface and its effect on corrosion resistance. Corrosion science, ISSN 0010-938X. Jul. 2017, vol. 123, str. 21-26, [COBISS.SI-ID 15482907]

4.  CONRADI, Marjetka, KOCIJAN, Aleksandra. Comparison of the surface and anticorrosion properties of SiO[sub]2 and TiO[sub]2 nanoparticle epoxy coatings , Materiali in tehnologije, ISSN 1580-2949. 2017, vol. 51, no. 6, str.1043-1046, [COBISS.SI-ID 1370026]

5. CONRADI, Marjetka, KOCIJAN, Aleksandra. Surface and anticorrosion properties of hydrophobic and hydrophilic TiO[sub]2 coatings on a stainless-steel substrate. Materiali in tehnologije, ISSN 1580-2949. 2016, letn. 50, št. 6, str. 967-970 [COBISS.SI-ID 1274538]

6. CONRADI, Marjetka, DRNOVŠEK, Aljaž, GREGORČIČ, Peter. Wettability and friction control of a stainless steel surface by combining nanosecond laser texturing and adsorption of superhydrophobic nanosilica particles. Scientific reports, ISSN 2045-2322, May 2018, vol. 8, f. 1-9, [COBISS.SI-ID 16039707]

7. KOCIJAN, Aleksandra, CONRADI, Marjetka, DONIK, Črtomir. Corrosion resistance of superhydrophilic and superhydrophobic TiO₂/epoxy coatings on AISI 316L stainless steel. Materiali in tehnologije, ISSN 1580-2949. 2018, letn. 52, št. 4, str. 383-388, [COBISS.SI-ID 1416362]

8. KOCIJAN, Aleksandra, CONRADI, Marjetka, HOČEVAR, Matej, DROBNE, Damjana. Comparative study of superhydrophilic and superhydrophobic TiO2/epoxy coatings on AISI 316L stainless steeel : surface properties and biocompatibility. Materiali in tehnologije, ISSN 1580-2949. 2018, letn. 52, št. 3, str. 355-361, [COBISS.SI-ID 1404842]

1.08 Objavljeni znanstveni prispevek na konferenci

9. KOCIJAN, Aleksandra, CONRADI, Marjetka, DONIK, Črtomir, HOČEVAR, Matej, DROBNE, Damjana. Comparative study of superhydrophilic and superhydrophobic TiO[sub]2/epoxy coatings on AISI 316L stainless steel. V: Book of abstracts 2018, 6th World Congress and Expo on Nanotechnology and Materials Science, April 16-18, 2018, Valencia, Spain. Hyderabad: Scientific Future Group. 2018, str. 100. [COBISS.SI-ID 1393834] 

1.10 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci (vabljeno predavanje)

10. CONRADI, Marjetka, KOCIJAN, Aleksandra, SEVER, Tina, GREGORČIČ, Peter. Influence of aging on surface properties of laser-textured and epoxy/TiO [sub] 2 coated stainless steel. V: GODEC, Matjaž (ur.), et al. Program in knjiga povzetkov = Program and book of abstracts, 26. Mednarodna konferenca o materialih in tehnologijah, 3.-5. oktober 2018, Portorož, Slovenija = 26th International Conference on Materials and Technology, 3-5 October 2018, Portorož, Slovenia. Ljubljana: Inštitut za kovinske materiale in tehnologije. 2018, f. 35. http://mit.imt.si/Revija/izvodi/mit184/BookOfAbstracts_26ICM&T.pdf. [COBISS.SI-ID 16285467] 

1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci

11. KOCIJAN, Aleksandra, CONRADI, Marjetka, DONIK, Črtomir, HOČEVAR, Matej, DROBNE, Damjana, GODEC, Matjaž. Nanostructured superhydrophilic and superhydrophobic TiO2/epoxy coatings on AISI 613L stainless steel. V: GODEC, Matjaž (ur.), et al. Program in knjiga povzetkov = Program and book of abstracts, 26. Mednarodna konferenca o materialih in tehnologijah, 3.-5. oktober 2018, Portorož, Slovenija = 26th International Conference on Materials and Technology, 3-5 October 2018, Portorož, Slovenia. Ljubljana: Inštitut za kovinske materiale in tehnologije. 2018, f. 70. http://mit.imt.si/Revija/izvodi/mit184/BookOfAbstracts_26ICM&T.pdf. [COBISS.SI-ID 1457066] 

12. CONRADI, Marjetka, SEVER, Tina, KOCIJAN, Aleksandra, GREGORČIČ, Peter. Vpliv staranja na površinske ter korozijske lastnosti lasersko teksturiranih in kemijsko modificiranih površin jekla. V: OSTERMAN, Natan (ur.), ŠKARABOT, Miha (ur.). Zbornik povzetkov, 11. konferenca fizikov v osnovnih raziskavah, Dobrna, 23. november 2018. V Ljubljani: Fakulteta za matematiko in fiziko. 2018, str. [30], ilustr. [COBISS.SI-ID 1439146] 

13. KONONENKO, Veno, KOCIJAN, Aleksandra, CONRADI, Marjetka, HOČEVAR, Matej, DROBNE, Damjana. Cell adhesion to stainless steel plates with different surface modifications. V: ZAVAŠNIK, Janez (ur.), et al. 2. slovensko posvetovanje mikroskopistov, 11. in 12. maj 2017, Piran, Slovenija : knjiga povzetkov = 2nd Slovene Microscopy Symposium : book of abstracts. 1. izd. Ljubljana: Slovensko društvo za mikroskopijo. 2017, str. 54. [COBISS.SI-ID 4326735] 

14. CONRADI, Marjetka, KOCIJAN, Aleksandra, DONIK, Črtomir, HOČEVAR, Matej, DROBNE, Damjana, GODEC, Matjaž. Surface properties, corrosion resistance and biocompatibility properties of superhydrophilic and superhydrophobic TiO[sub]2/epoxy coatings on AISI 316L stainless steel. V: GODEC, Matjaž (ur.), et al. Program in knjiga povzetkov = Program and book of abstracts, 25. mednarodna konferenca o materialih in tehnologijah, 16.-19. oktober 2017, Portorož, Slovenija = 25th International Conference on Materials and Technology, 16-19 October 2017, Portorož, Slovenia. Ljubljana: Inštitut za kovinske materiale in tehnologije. 2017, str. 47. http://icmt25.com/e_files/content/Preliminary_BookOfAbstracts_25ICM&T.pdf. [COBISS.SI-ID 1349290] 

15. KOCIJAN, Aleksandra, CONRADI, Marjetka. Comparison of surface and anticorrosion properties of SiO[sub]2 and TiO[sub]2 nanoparticle epoxy coatings. V: GODEC, Matjaž (ur.), et al. Program in knjiga povzetkov = Program and book of abstracts, 25. mednarodna konferenca o materialih in tehnologijah, 16.-19. oktober 2017, Portorož, Slovenija = 25th International Conference on Materials and Technology, 16-19 October 2017, Portorož, Slovenia. Ljubljana: Inštitut za kovinske materiale in tehnologije. 2017, str. 97. http://icmt25.com/e_files/content/Preliminary_BookOfAbstracts_25ICM&T.pdf. [COBISS.SI-ID 1356202]